Ubicada junto a una de las galerías del claustro, su planta presenta una sola nave dividida en cinco tramos, de proporciones claramente rectangulares. Primitivamente estuvo cubierta con un artesonado de madera, que en la actualidad tan sólo se conserva en su prolongación por el coro alto. Hoy en día su techumbre es de medio cañón con lunetos compartimentada por arcos fajones, que en la capilla mayor apean sobre pilares, mientras que en el resto de la nave, se recogen en pinjantes a la altura de cornisas. Esta cubierta se fecha mediante una inscripción que recoge Rodríguez Duarte y en la que se puede leer: Esta obra se hizo siendo abadesa la Me. Sr. Margarita Penillo y Mayordomo D. Ignacio Zevallos, y el maestro fue Juan Rodríguez Portillo. Año de 1730".
Se comenzó bajo la dirección de Alonso de Vandelvira durante los años finales de la primera década del siglo XVII. Su mano se puede observar en la cubierta de la capilla mayor, donde ha desarrollado un interesante programa ornamental e iconográfico. El primero se resolvió con relieves de cartones recortados en forma de octógonos y óvalos en los que se pintaron los símbolos de las letanías lauretanas, junto a los Eucarísticos. En el óvalo central se representó una nave portando una custodia con la inscripción "NAVIS INSTORIS DE LOGE PORTAS PANIS". Del mismo autor es la composición del muro del coro de la iglesia, aunque en esta también intervino Cristóbal de Rojas. Este se divide en un cuerpo bajo de doble altura en la que se encuentra la reja y flanqueándola a cada lado la cratícula y el confesionario. El remate en forma de frontón repite el mismo modelo que el de la hornacina de las portadas de la iglesia. Sobre la reja existe un importante altorrelieve representando la imposición de la casulla a San Ildefonso con una inscripción en la que se lee: "SOLI DEO HONOR ET GLORIA". En las hornacinas que lo flanquean se sitúan imágenes de San Juan Bautista y San Juan Evangelista. El segundo cuerpo, sobre la cornisa, presenta la reja del coro alto y dos hornacinas adinteladas en las que se hallan las imágenes de San Francisco y Santa Paula. Por encima de ellos, hoy tapados por la bóveda, se encuentran los escudos ducales realizados en 1606 por Francisco de La Gándara y Acevedo.
Por lo que se refiere a la decoración de la iglesia se debe destacar la serie de lienzos, ubicados en la zona alta de los muros, en la que se ha representado la vida de la Virgen. Estos pueden datarse a principios del siglo XVIII. En el muro de la epístola se puede observar, sobre una peana adosada a la pared, el grupo de Santa Ana instruyendo a la Virgen de mediado el siglo XVIII. Tras este se halla un retablo en cuya hornacina central se ubica la Virgen de los Dolores, flanqueada por una santa franciscana y por un santo jesuita. Todo el conjunto es también del siglo XVIII.
Más interesante resulta el siguiente retablo estructurado en un cuerpo de tres calles mediante estípites, pudiendo datarse a mediados del siglo XVIII. La imagen de los Dolores que ocupa su hornacina central es del mismo momento, un poco posteriores son el San Francisco situado a su derecha y el Cristo atado a la columna.
En el presbiterio destaca el retablo mayor que preside la iglesia, tras el cual aún se conservan restos del primitivo realizado mediante pinturas al temple.
En el muro del evangelio existe un retablo del siglo XVIII, con una imagen reciente de la Virgen de Regla a la que acompañan a la izquierda San Juan Evangelista y a su derecha Santa Rosa de Lima. A continuación se ubica el retablo dedicado a Santa Clara, acompañada por San Rafael y San Joaquín. El ático lo ocupa un relieve del Espíritu Santo. Para concluir con el mobiliario religioso de la iglesia se debe prestar atención al púlpito y su tornavoz realizado en 1755.